Caspase 识别切割GSDMD的机理

发布于 26 天前  24 次阅读


高级蛋白质生物化学作业,看Structural Mechanism for GSDMD Targeting by Autoprocessed Caspases in Pyroptosis这一篇文献。老师应该不会顺着网线找到这里的吧🤷‍♂️

背景:

细胞在收到感染后,如果细胞本身能够识别其受损状态,它将激活细胞内在死亡机制,包括细胞内在凋亡(apotosis)、坏死(necriptosis)和焦亡(Pyroptosis)。焦亡作用可以通过消除受损细胞,从而消除病原体的保护、生存空间,同时引发炎症反应来抵御细胞内感染。焦亡是一种细胞程序性死亡,与凋亡和细胞坏死不同,它是一种坏死性细胞死亡,但是又是受控的。在细胞凋亡中,细胞收缩并分裂成凋亡小体,然后被周围的巨噬细胞吞噬,产生的是非炎症性质的细胞死亡,而焦亡更倾向于产生大量的炎症因子诱发炎症反应,同时增强免疫系统的应答(Shi et al., 2017)  。 在焦亡发生的过程中Gasdermins家族蛋白是焦亡的效应蛋白,Gasdermin蛋白在Caspase-1,Caspase-11/4/5的处理下,形成能造成焦亡的效应因子。Gasdermin D是焦亡的一个重要的因子,它能在细胞膜表面上打孔然后引发凋亡(Kovacs & Miao, 2017)。在人体内,gasdermin D是广泛表达的,但是它的全长并不具备焦亡的活性。它的N端是焦亡的效应蛋白,通过一段linker与C端的抑制蛋白连接,从而抑制了交往的活性。在caspase的处理下,linker被切断,N端的蛋白被释放,然后约16个N端gasdermin聚合在细胞膜上组成10-15nm的gasdermin pore,从而造成细胞内部的炎症因子外流,细胞外的水分内流,整个细胞如同一个被吹大的泡泡(Kovacs & Miao, 2017)。这就是焦亡的过程。

Caspase 识别切割GSDMD的机理

(Kovacs & Miao, 2017)

研究目的:Caspases如何识别GSDMD,GSDMD与caspase的活动的关系尚不清楚。所以,Kun Wang等为此研究了Caspase靶向切割GSDMD的结构机理。

实验手段:

作者首先构建了能够特异识别GSDMDN端或者C端的抗体,用以分辨切割前后的GSDMD以及各分段。然后再探究caspase-4在什么情况下才能切割GSDMD。在知道了caspase-4只有在Asp289自我切割后才起作用后,作者进一步探究caspase-4是如何识别GSDMD以及在哪里切割GSDMD的。最后,作者对caspase-4的结构进行分析,进一步阐明caspase-4识别、切割GSDMD的机理,并同时发现caspase-1以相同的机理识别、切割GSDMD。

实验结果 :

Cleavage-Specific Anti-GSDMD Antibodies Detect Caspase-1, -4, or -11 Activation-Induced Pyroptosis

为了证实GSDMD是被caspase以位点特异性切开的,作者首先开发了特异识别切开后的GSDMD的抗体去检测GSDMD的切割情况。对于鼠GSDMD,即mGSDMD,作者开发了针对被caspase-1/11切割后产生的mGSDMD-C段的这一段抑制蛋白的单克隆抗体以及针对人GSDMD-N的c末端的FLTD motif的单克隆抗体。在图1的westernblot中能看到这些单克隆靶向性良好,只能靶向切割后的GSDMD-C段蛋白,并且能在诱发焦亡后的细胞上清中检测到GSDMD-C的存在;在细胞图中,可以看到抗体靶向的都是形态异常的细胞,即像被吹胀成球一样的细胞(Fig 1.C)和裂解开的细胞(Fig 1.D)

Caspase 识别切割GSDMD的机理

LPS Activation of Caspase-4 Only Requires Autoprocessing at the Conserved Asp289

尽管已经有报道表明caspase-11在Asp285处自切割然后裂解GSDMD并诱导焦亡,但是它是否还有别的自我切割位点以及caspase-4 的作用尚未得知。作者纯化了昆虫的caspase-4,并在转染LPS诱发焦亡后检测到p31,p24,p12,p10这几个caspase-4片段(Fig 2.A),Caspase-4 的切割位点如图Fig 2.B 。 先前的报道中已经证明了Asp59是否发生切割对GSDMD的切割并不重要,在C和D图中作者把Asp59突变为Ala,发现转染LPS后发生焦亡的情况与WT一致,重现了先前报道的结果。对于Asp270位点,从E中可以看到在转染了LPS后,p31只能在上清中检测到,而不能在细胞裂解液中检测。该结果与沙门氏菌侵染细胞引发焦亡后的结果一致,并且在将Asp270点突变后,焦亡依然可以发生。所以可以认为Asp270的切割对焦亡没有影响。并且在这个情况下,p31就没了,取而代之的是p33的条带,这是在Asp289切割后产生的。至于Asp289,这个地方点屠边后就无法再发生焦亡了,再G 中可以看到GSDMD-N检测不到了,在H中cell death显著减少。根据这些数据,可以知道caspase-4只需要再Asp289发生切割就能发挥正常功能了

Caspase 识别切割GSDMD的机理

Autoprocessed Caspase-4/11 Recognizes and Cleaves GSDMD Independently of the Tetrapeptide in GSDMD

在了解到caspase-4/11的自我切割方式后,作者进一步探究caspase-4/11自我切割与其GSDMD靶向性的联系。在293T中,caspase-4(C258A)经过在Asp289处理后产生的p33和p10都能够发现与GSDMD发生互作,在A图中可以看到针对Flag标签的免疫共沉淀中,检测到了三条条带。这一现象只发生在GSDMD中,GSDMA没有,而且在input中可以看到蛋白都是存在的。这也就说明了caspase-4切割后的p33和p10能且只能特异识别GSDMD。

一般来说,cpaspae其原理是它能识别底物中的裂解位点的四肽,在发挥功能时会特异性地进攻蛋白质中的半胱氨酸残基(C)和切断天冬氨酸残基(D)后面的肽键。但是将GSDMD的272FLTD275突变为AAAD或者D275A后,在B图中我们仍然可以看到caspase-4的p33/p10能够识别GSDMD。但是在C和D图中我们可以看到,转染了LPS后,AAAD的GSDMD任然能够诱发GSDMD的切割以及焦亡,而D275A不能。在EF图中可以看到,将WT的GSDMD以及GSDMD-AAAD提纯后,在体外用LPS-activated caspase-4/11 处理发现,两种GSDMD的处理结果一致。

综上,caspase-4只有在发生自我切割后才能识别GSDMD,并且识别方式并不依赖于特定的四个氨基序列,但是切割还是需要D的存在的。

Caspase 识别切割GSDMD的机理

The GSDMD-C Domain Mediates Recognition by Autoprocessed Caspase-4/11

在确定了caspase识别切割位置后,发现caspase识别不按常理来识别特定4个氨基酸序列,也许是跟结构相关。作者发现这个识别的过程是由C端介导的,而与N端无关。所以作者就做了几个融合蛋白,把GSDMD的N端或者C端分别用别的蛋白进行替换,最终发现识别的都是C端,而且把N端用GST替换后,识别、切割依旧正常。

在有了以上实验结果的基础上,作者对caspase的结构进行分析,分析了一下其不同切割状态下结构对识别GSDMD的影响以及机理,得到了疏水界面介导的底物结合可增强caspase-4/11的肽酶活性等结论。并且发现了caspase-1也具有caspase-4类似的识别GSDMD的机制。

小结

根据以上的信息,作者画出了一张caspase切割GSDMD的流程图。Caspase-1/4/11的前体在被切割后,形成的两个片段能够通过疏水作用特异的识别到GSDMD的C端,并在XXXD位置进行切割,使GSDMD-C与GSDMD-N分离。GSDMD-N在解除了抑制后,多个GSDMD-N在细胞膜上多聚化形成GSDMD pore, 直径约10-15nm。然后,细胞内容物外流,外部的液体内流,细胞肿胀、破裂,同时释放出大量的白细胞介素IL-1β等炎症因子。

Caspase 识别切割GSDMD的机理

同时还参考了以下文献综述:

参考文献:

Kovacs, S. B., & Miao, E. A. (2017). Gasdermins: Effectors of Pyroptosis. Trends in Cell Biology, 27(9), 673–684. https://doi.org/10.1016/j.tcb.2017.05.005

Shi, J., Gao, W., & Shao, F. (2017). Pyroptosis: Gasdermin-Mediated Programmed Necrotic Cell Death. Trends in Biochemical Sciences, 42(4), 245–254. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2016.10.004


我欲乘风归去,又恐琼楼玉宇,高处不胜寒。